【干货】扫描电镜生物样品制备技术

admin · 发表于 2020-10-14 22:12:10

<img src="image/20201014/95b80f60020cc3824a6b1afb671f3c5f_1.jpg" /> <section><section><section>一</section><section data-brushtype="text">样品的初步处理</section></section></section><section><h2>1取材</h2></section> 取材的基本要求和透射电镜样品制备相同，但是，对扫描电镜来说，样品可以稍大些，面积可达8mm×8mm，厚度可达5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面。 <section><h2>2样品的清洗</h2></section> 用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面，即组织的游离面。由于样品取自活体组织，其表面常有血液、组织液或粘液附着，这会遮盖样品的表面结构，影响观察。因此，在样品固定之前，要将这些附着物清洗干净。清洗的方法有以下几种： <ul><li>用等渗的生理盐水或缓冲液清洗；</li><li>用5%的苏打水清洗；</li><li>用超声震荡或酶消化的方法进行处理。</li></ul>例如清洗肠粘膜表面的粘液，可用下面的方法：将样品浸泡在配好的清洗液中，边浸泡边震荡30分钟，最后用双蒸水洗3次。（清洗液配方：透明质酸酶 300 μg α-糜蛋白酶,10 ml生理盐水,100 ml清洗液的pH为5.5～6。）无论用哪种清洗方法，注意在清洗时不要损伤样品。 <section><h2>3固定</h2></section> 固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。由于样品体积较大，固定时间应适当延长。 <section><h2>4脱水</h2></section> 样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。 <img src="image/20201014/90d530ba8d5db2cc52986425282f5a37_2.jpg" /> Leica EM TP全自动组织处理机操作简单,重复性,重现性强,可以实现化学固定,脱水等一些列工作。 <section><section><section>二</section><section data-brushtype="text">样品的干燥</section></section></section> 扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。无论是水或脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构。因此，样品在用电镜观察之前必须进行干燥。干燥的方法有以下几种： <section><h2>1空气干燥法</h2></section> 空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，该方法一般只适用于表面较为坚硬的样品。 <section><h2>2临界点干燥法</h2></section> 临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。这样就可以避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。此法操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2～3小时即可完成，所以是最为常用的干燥方法。但用此法，需要特殊仪器设备。临界点干燥是在临界点干燥仪中进行的，操作步骤如下：<ul><li>固定、脱水：按常规方法进行。如样品是用乙醇脱水的，在脱水至100%后，要用纯丙酮置换15～20分钟。</li><li>转入中间液：由纯丙酮转入中间液醋酸异戊酯中，时间约15～30分钟。</li><li>移至样品室：将样品从醋酸异戊酯中取出，放入样品盒，然后移至临界点干燥仪的样品室内，盖上盖并拧紧以防漏气。</li><li>用液体二氧化碳置换醋酸异戊酯：在达到临界状态(31℃ , 72.8大气压)后，将温度再升高10℃，使液体二氧化碳气化，然后打开放气阀门，逐渐排出气体，样品即完全干燥。</li></ul><img src="image/20201014/75d974e2ebb917c04ed765d0f5692332_3.jpg" /> Leica EM CPD300全自动临界点干燥仪操作方便,可以调节各种参数,适合多种不同样品的临界点干燥。 <section><h2>3冷冻干燥法</h2></section> 冷冻干燥法是将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程。冷冻干燥的基础是冰从样品中升华，即水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液态，不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，从而减轻在干燥过程中对样品的损伤。冷冻干燥法有两种，即含水样品直接冷冻干燥和样品脱水后冷冻干燥。 <ul><li>含水样品直接冷冻干燥法</li></ul>1、取材固定：按常规方法进行。2、置于冷冻保护剂中：将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。常用的冷冻保护剂为10%～20%二甲基亚砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液。3、骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150(C的氟利昂冷冻剂中，使样品中的水分很快冻结。4、干燥：将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上，抽真空，经几小时或数天后，样品即达到干燥。本方法不需要脱水，避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用，不会使样品收缩，也是较早使用的方法。但是，由于花费时间长，消耗液氮多，容易产生冰晶损伤，因此未被广泛应用。<ul><li>样品脱水后冷冻干燥</li></ul>样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂一起冷冻并在真空中升华而达到干燥。和前一种方法比较，本方法的优点是不会产生冰晶损伤，且干燥时间短。不足之处是有机溶剂对样品成分有抽提作用，造成部分内含物丢失。乙腈(acetonitrile)真空干燥法：这是一种利用乙腈在急速蒸发时会冷却固化的性质将样品干燥的方法。其操作步骤如下：1、固定、水洗：按常规方法进行。2、乙腈置换：使用50%、70%、80%、90%的乙腈水溶液置换，最后用100%乙腈代替，每步骤15～20分钟。3、干燥：至纯乙腈时，放入真空镀膜台抽真空，乙腈和样品在真空中很快致冷而被冻结(冻结的温度为-45℃)，变成冰状固体。然后继续抽真空，使冻结的乙腈升华，约需30分钟，样品即达干燥。样品干燥后要粘在样品台上。对于不镀膜而直接观察的样品，必须用导电胶来粘固；对于要镀膜的样品，则可以用胶水或万能胶来代替，微细的样品如粉末、纤维等也可用双面胶纸来粘贴。 <section><section><section>三</section><section data-brushtype="text">样品的导电处理</section></section></section> 生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。常用的导电方法是金属镀膜法: 金属镀膜法是采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、钯等蒸发后覆盖在样品表面的方法。样品镀以金属膜后，不仅可以防止荷电效应，还可以减少电子束对样品的损伤，增加二次电子的产生率，获得良好的图象。 <img src="image/20201014/05022449d3516c17511c5f95cf71f4a1_4.jpg" /> Leica EM ACE系列的镀膜仪在技术上有新的创新:<ul><li>大的样品舱室可以容纳更多的样品</li><li>旋转的样品台可以使镀膜更加的均匀</li><li>靶材可以有碳和金2种,可以根据您的需要随时更换</li><li>全金属的外壁,密封性极好</li><li>操作简便，清洁简便</li></ul> <section><section><section>四</section><section data-brushtype="text">处理好的样品可以直接上扫描电子显微镜下观察</section></section></section> <ul><li>黑曲霉 Black mould (Aspergilus niger)</li></ul><img src="image/20201014/9ed56702e9841fda40f0e278eb09b7be_5.jpg" /> <ul><li>水蚤Water Flea (Daphnia sp.)<img src="image/20201014/d50dc35136b07aae2ac770a30e8a4c3f_6.jpg" /> </li><li>爪蛙Clawed Frog (Xenopus laevis)核孔,内侧Nuclear pores, inside</li></ul><img src="image/20201014/4d9c3de63ad1c9112ee44068209fe744_7.jpg" /> <ul><li>大肠杆菌 Bacteria (E.coli )</li></ul><img src="image/20201014/df59d7203889f07a81c45c29645a1345_8.jpg" /> <ul><li>血红细胞 Human Red Blood Cells</li></ul><img src="image/20201014/03b53f97c138fd5e73fa3965db5f810e_9.jpg" /> <ul><li>水稻花药表面 Rice Anther</li></ul><img src="image/20201014/3175bc492e20f0cb61fa0e5da8a859f6_10.jpg" /> <ul><li>烟草 Tobacco (Nicotiana tabacum)叶毛 Trichomes with Stomata</li></ul><img src="image/20201014/9647d1f92139aa583e8d5dee3a09e900_11.jpg" /> <ul><li>烟草 Tobacco (Nicotiana tabacum)叶片表面的气孔 Stoma</li></ul><img src="image/20201014/33aed838fe5e3ab0b6a61e2e27551d6e_12.jpg" /> 感谢读完 本文由“徕卡显微系统”提供，转载请注明来源。<img src="image/20201014/7e7e722d88a93a487b5a85d07dac2d70_13.jpg" />推荐文章 回复1阅读：医疗器械销售必读回复2阅读：为什么公立医院购买的大设备会那么贵回复3阅读：对比Siemens、Philips、GE、Toshiba高端CT回复4阅读：西门子和GE通用的区别回复5阅读：咱们这个行业里的汽车之家国内首家医疗器械门户网站回复6阅读：参展商你就为了在CMEF刷存在感吗？回复7阅读：监护仪选购原则回复8阅读：你不可不知的医疗器械采购年鉴回复9阅读：2015年最全的国内外医疗器械展会目录回复10阅读：30余家国内外彩超大品牌销售数据谁是土豪谁屌丝一看便知其他内容回复精彩列表阅读：可以获得我们为您精心准备的资讯。 版权声明：部分文章和信息来源于互联网，不代表本订阅号赞同其观点和对其真实性负责。如转载稿涉及版权等问题，请立即和我们联系，我们以迅速采取适当措施<table cellspacing="0" cellpadding="0" width="667"><tbody><tr><td><fieldset><section><section>器械科网站（www.qixieke.com）是中国首家资讯覆盖全国、且以产品为核心的医疗器械门户媒体网站，致力于成为中国最具影响力的医疗器械行业门户及媒体。器械科网站是集产品数据、专业资讯、行业动态、受众互动为一体的复合型媒体，也是专业互联网医疗器械领域中最大的深度垂直媒体门户。 微信公众号：器械科官方网站http://www.qixieke.com http://器械科.中国器械科网创始人微信号 shiyun8766 </section></section></fieldset></td></tr></tbody></table><img src="image/20201014/9207b4ed6719b2cad2362c6dbc6dbe16_14.jpg" />

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